Вопрос вообщем-то прост.

как средствами самого языка запретить запуск второго экземпляра приложения.

в первую очередь вопрос касается платформы Windows

1. Через отслеживание приложения в списке процессов Windows. Не знаю, как сделать это на Python. Есть ещё вариант с парсингом output'а команды tasklist.
2. При старте приложения открывать для записи определённый файл и оставлять открытым до завершения программы. Если открыть файл не удалось - значит он залочен уже открытой программой и программу можно не выполнять.